مقایسه کارآیی اتیدیوم مونوآزید (EMA) و پروپیدیوم مونوآزید (PMA)در شمارش سلول های زنده پاتوژن به روش PCR زمان واقعی در سیستم های مدل غذایی

نویسندگان
مریم عزیزخانی
فهیمه توریان
دانشگاه تخصصی فناوری های نوین آمل
چکیده
تکنیک PCR علاوه بر DNA سلول های زنده، سلول های مرده را نیز شمارش می کند و این امر قضاوت در مورد کیفیت میکربی نمونه های غذایی را دچار مشکل می نماید. هدف این مطالعه مقایسه تکنیک های اتیدیوم مونوآزیدqPCR- و پروپیدیوم مونوآزید-qPCR در شمارش سلول های پاتوژن (اشرشیاکلی، استافیلوکوکوس ارئوس، انتروکوکوس فیکالیس و لیستریامونوسیتوجنس) در نمونه های شیر کم چرب و پرچرب، پنیر لاکتیکی (کم چرب) و پنیر پروسس (پرچرب) بود. نسبت‌های مختلف از پاتوژن ‌های زنده و کشته شده توسط حرارت به نمونه های غذایی تلقیح گردید. پس از جداسازی پلت باکتریایی و تیمار باEMA و PMA ، PCR کمی انجام شد. آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون توکی جهت تحلیل داده ها بکار رفت. در نمونه شیر کم چرب، طی تیمار با EMA، کاهش 18، 20، 23 و 30 درصدی در شمارش اشرشیاکلی، استافیلوکوکوس اورئوس، انتروکوکوس فکالیس و لیستریامونوسیتوجنس در مقایسه با کشت معمولی مشاهده شد. همچنین در تیمار با PMA در همین نمونه کاهش 6، 3، 8 و 12 درصدی در شمارش اشرشیاکلی، استافیلوکوکوس اورئوس، انتروکوکوس فکالیس و لیستریامونوسیتوجنس به دست آمد. در نمونه های غذایی پرچرب مانند پنیر پروسس در تیمار با EMA، کاهش 20، 27، 30 و 25 درصدی و در تیمار با PMA کاهش 9، 6، 10 و 5 درصدی در تعداد، به ترتیب، اشرشیاکلی، استافیلوکوکوس اورئوس، انتروکوکوس فکالیس و لیستریامونوسیتوجنس مشاهده گردید. درجه بازداری EMA و PMA از تولید سیگنال در باکتری های مختلف متفاوت بود و درصد چربی نمونه ها تاثیر معناداری (05/0<p) بر کارآرایی EMA و PMA نداشت.

کلیدواژه‌ها
اتیدیوم مونوآزید
پاتوژن
پروپیدیوم مونوآزید
پی سی آر
سیستم های مدل غذایی

موضوعات

عنوان مقاله English

Comparing Efficacy of Ethidium Monoazide (EMA) and Propidium Monoazide (PMA) qPCR in Live Pathogen Quantifying by Real-Time PCR in Food Model Systems

نویسندگان English

Maryam Azizkhani
Fahimeh Tooryan
Amol University of Special Modern Technologies
چکیده English



PCR quantifies dead cells beside live cells and this makes the judgment of microbial quality of food samples complicated. The objective of this study was comparing the efficacy of ethidium monoazide-qPCR and propidium monoazide-qPCR in quantifying live pathogen cells (E.coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus fecalis and Listeria monocyogenes) by real time PCR, in low-fat and high-fat milk, lactic cheese (low-fat) and processed cheese (high-fat). Different proportions of live and heat killed pathogen cells were inoculated into food samples. After separating bacterial pellets, EMA and PMA treatments qPCR was conducted. One-way ANOVA followed by Turkey’s Multiple Comparison tests were applied to analyze the data. In low-fat milk, EMA treatment resulted in 18, 20, 23 and 30% decrease in cell count of E.coli, S.aureus, E. fecalis and L. monocyogenes, respectively, compared to conventional culturing. Also, following treatment by PMA, 6, 3, 8 and 12% decrease in cell count was obtained for E.coli, S.aureus, E. fecalis and L. monocyogenes, respectively, compared to conventional culturing. In high-fat samples as processed cheese, a reduction of 20, 27, 30 and 25% in EMA treatment and 9, 6, 5 and 10% in PMA treatment was observed in cell count of E.coli, S.aureus, E. fecalis and L. monocyogenes , respectively. The inhibitory potential of EMA and PMA against signal emission was variable in different bacterial species and the fat content of the samples exerted no significant effect (p>0.05) on PMA and EMA functionality.

کلیدواژه‌ها English

ethidium monoazide
food model system
Pathogen
PCR
propidium monoazide
[1] Wagner, A.O., Praeg, N., Reitschuler, C., Illmer, P. 2015. Effect of DNA extraction procedure, repeated extraction and ethidium monoazide (EMA)/propidium monoazide (PMA) treatment on overall DNA yield and impact on microbial fingerprints for bacteria, fungi and archaea in a reference soil. Applied Soil Ecology, 93, 56–64.
[2] Nocker, A., Camper, A.K. 2006. Selective removal of DNA from dead cells of mixed bacterial communities by use of ethidium monoacide. Applied Environmental Microbiology, 72, 1997–2004.
[3] Nocker, A., Cheung, C.Y., Camper, A.K. 2006. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods, 67, 310–320.
[4] Trevors, J. 2012. Can dead bacterial cells be defined and are genes expressed after cell death? Journal of Microbiological Methods, 90, 25–28.
[5] Leifels, M., Jurzik, L., Wilhelm, M., Hamza, I.A. 2015. Use of ethidium monoazide and propidium monoazide to determine viral infectivity upon inactivation by heat, UV- exposure and chlorine. International Journal of Hygiene and Environmental Health, 218 (8), 686–693.
[6] Jeong, M.I., Park, S.Y., Ha, S.D. 2017. Thermal inactivation of human norovirus on spinach using propidium or ethidium monoazide combined with real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction. Food Control, 78, 79-84.
[7] Elizaquivel, P., Sanchez, G., Selma, M.V., Aznar, R. 2012. Application of propidum monoazide-qPCR to evaluate the ultrasonic inactivation of Escherichia coli O157:H7 in fresh-cut vegetable wash water. Food Microbiology, 30, 316-320.
[8] Wagner, A.O., Malin, C., Knapp, B.A., Illmer, P. 2008. Removal of Free Extracellular DNA from Environmental Samples by Ethidium Monoazide and Propidium Monoazide. Applied Environmantal Microbiology, 2537–2539.
[9] Kerényi, M., Allison, H. E., Bátai, I., Sonnevend, Á., Emödy, L., Plaveczky, N., et al. 2005. Occurrence of hlyA and sheA genes in extraintestinal Escherichia coli strains. Journal of Cliniacal Microbiology, 43(6), 2965-2968.
[10] Fischer, A., Francois, P., Holtfreter, S., Broker, B., et al. 2009. Development and evaluation of a rapid strategy to determine enterotoxin gene content in Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods, 77, 184-190.
[11] Waters, C.M., Antiporta, M.H., Murray, B.E., Dunny, G.M. 2003. Role of the Enterococcus faecalis GelE Protease in Determination of Cellular Chain Length, Supernatant Pheromone Levels, and Degradation of Fibrin and Misfolded Surface Proteins. Journal of Bacteriology, 185(12), 3613–3623.
[12] van Frankenhuyzen, J.K., Trevors, J.T., Flemming, C.A., Lee, H., Habash, M.B. 2013. Optimization validation, and application of a real-time PCR protocol for quantification of viable bacterial cells in municipal sewage sludge and biosolids using reporter genes and Escherichia coli. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 40, 1251–1261.
[13] Shi, H., Xu, W., Luo, Y., Chen, L., Liang, Z., Zhou, X., Huang, K. 2011. The effect of various environmental factors on the ethidium monazite and quantitative PCR method to detect viable bacteria. Journal of Applied Microbiology, 111 (5), 1194–1204.
[14] Elizaquivel, P., Aznar, R., Sanchez, G. 2014. Recent developments in the use of viability dyes and quantitative PCR in the food microbiology field. Journal of Applied Microbiology, 116 (1), 1–13.
[15] Soejima, T., Schlitt-Dittrich, F., Yoshida, S. 2011. Polymerase chain reaction amplification length-dependent ethidium monoazide suppression power for heat-killed cells of Enterobacteriaceae. Analytical Biochemistry, 418, 37–43.
[16] Martin, B., Raurich, S., Garriga, M., Aymerich, T. 2013. Effect of amplicon length in propidium monoazide quantitative PCR for the enumeration of viable cells of salmonella in cooked ham. Food Analytical Methods, 6, 683–690.
[17] Soejima, T., Minami, J., Iwatsuki, K. 2012. Rapid propidium monoazide PCR assay for the exclusive detection of viable Enterobacteriaceae cells in pasteurized milk. Journal of Dairy Science, 95(7), 3634-3642.
[18] Chen, Z., Dexin, Z., Nan, L., Jianjun, D., Feng, X.,Yuan, J., Baoguang, L. 2018. An improved assay for rapid detection of viable Staphylococcus aureus cells by incorporating surfactant and PMA treatments in qPCR. BMC Microbiology, 18: 132.